Joma biotehnoloģija ir viena no nemainīgām izmaiņām. Straujāko progresīvo pētījumu attīstība un attīstība ir atkarīga no inovācijām un radošuma zinātnieki un viņu spēja saskatīt potenciālu pamatmolekulārajā tehnikā un pielietot to jaunajā procesi. Polimerāzes ķēdes reakcijas parādīšanās (PCR) pavēra daudzas iespējas ģenētiskajā izpētē, ieskaitot līdzekļus DNS analīze dažādu gēnu identificēšana, pamatojoties uz to DNS sekvencēm. DNS secība ir atkarīga arī no mūsu spējas izmantot gēla elektroforēze atdalīt DNS virknes, kuru izmēri atšķiras tikai par vienu bāzes pāri.
DNS sekvencēšana
70. gadu beigās tika izgudrotas divas DNS secības noteikšanas metodes garākām DNS molekulām: Sangera (vai didezoksi) metode un Maxam-Gilbert (ķīmiskās šķelšanas) metode. Maksama-Žilberta metode ir balstīta uz nukleotīdiem raksturīgu šķelšanu ar ķīmiskām vielām, un to vislabāk izmantot oligonukleotīdu (īsu nukleotīdu polimēru, parasti mazāku par 50 bāzes pāru garuma) secībai. Biežāk tiek izmantota Sangera metode, jo ir tehniski pierādīts, ka to ir vieglāk piemērot, tāpat kā PĶR parādīšanās un tehnikas automatizācija ir viegli pielietojama garām DNS virknēm, ieskaitot dažas veselas gēni. Šīs tehnikas pamatā ir ķēdes izbeigšana ar dideoksinukleotīdiem PĶR pagarināšanas reakciju laikā.
Sangera metode
Sangera metodē analizējamo DNS šķiedru izmanto kā šablonu, un DNS polimerāzi PCR reakcijā izmanto, lai ģenerētu papildinošās virknes, izmantojot grunti. Tiek sagatavoti četri dažādi PCR reakcijas maisījumi, katrs satur noteiktu procentuālo daudzumu dideoksinukleozīdu trifosfāta (ddNTP) analogu vienam no četriem nukleotīdiem (ATP, CTP, GTP vai TTP).
Jaunās DNS virknes sintēze turpinās, līdz tiek iestrādāts viens no šiem analogiem, un šajā laikā virkne tiek priekšlaicīgi saīsināta. Katra PĶR reakcija galu galā satur dažāda garuma DNS virkņu maisījumu, visi beidzas ar nukleotīdu, kurš šai reakcijai tika iezīmēts ar dideoksigrupu. Želeja elektroforēze pēc tam izmanto, lai četrās atsevišķās joslās atdalītu četru reakciju virzienus un noteiktu sākotnējā šablona secību, pamatojoties uz to, kāds šķiedru garums beidzas ar kādu nukleotīdu.
Automatizētajā Sangera reakcijā tiek izmantoti grunti, kas marķēti ar četrām dažādu krāsu fluorescējošām atzīmēm. PCR reakcijas dažādu dideoksinukleotīdu klātbūtnē veic, kā aprakstīts iepriekš. Tomēr pēc tam četrus reakcijas maisījumus apvieno un uzliek vienā gela joslā. Katra fragmenta krāsa tiek noteikta, izmantojot lāzera staru, un informāciju vāc ar datoru kas ģenerē hromatogrammas ar katras krāsas virsotnēm, no kurām var veidoties DNS matricas secība noteikts.
Parasti automatizētā secības noteikšanas metode ir precīza tikai tām sekvencēm, kuru maksimālais garums ir aptuveni 700-800 bāzes pāri. Tomēr, izmantojot pakāpeniskas metodes, piemēram, Primer Walking un Shotgun secību, ir iespējams iegūt lielākas gēnu un faktiski veselu genomu pilnas sekvences.
Grunts staigāšanā lielākas gēna funkcionējošā daļa tiek secēta, izmantojot Sangera metodi. Jauni praimeri tiek ģenerēti no uzticama sekvences segmenta un tiek izmantoti, lai turpinātu sekvenēt to gēna daļu, kas atradās ārpus sākotnējām reakcijām.
Bise sekvencēšana nozīmē nejauši izgrieztu interesējošo DNS segmentu piemērotākam (pārvaldāmu) lieluma fragmenti, katra fragmenta secība un gabalu kārtošana, balstoties uz pārklāšanos sekvences. Šo paņēmienu ir atvieglojusi datoru programmatūra, lai sakārtotu pārklājošos gabalus.