Restrikcijas endonukleāzes ir klase ferments kas sagriež DNS molekulas. Katrs enzīms atpazīst unikālas nukleotīdu secības DNS virknē - parasti apmēram četrus līdz sešus bāzes pārus. Secības ir palindromas, jo komplementārajai DNS virknei ir tāda pati secība apgrieztā virzienā. Citiem vārdiem sakot, abi DNS virzieni tiek sagriezti tajā pašā vietā.
Kur tiek atrasti šie fermenti
Restrikcijas fermenti ir atrodami daudzos dažādos baktēriju celmos, kur viņu bioloģiskā loma ir piedalīties šūnu aizsardzībā. Šie fermenti ierobežo svešas (vīrusu) DNS, kas nonāk šūnās, iznīcinot tās. Saimnieka šūnām ir restrikcijas modifikācijas sistēma, kas metilē viņu pašu DNS vietās, kas raksturīgas to attiecīgajiem restrikcijas fermentiem, tādējādi aizsargājot tās no šķelšanās. Vairāk nekā 800 zināmi fermenti ir atklāti, kas atpazīst vairāk nekā 100 dažādu nukleotīdu secību.
Ierobežojošo enzīmu veidi
Pastāv pieci dažādi restrikcijas enzīmu veidi. I tips izgriež DNS izlases vietās līdz 1000 vai vairāk bāzes pāriem no atpazīšanas vietas. III tipa griezumi atrodas apmēram 25 bāzes pāros no vietas. Abiem šiem veidiem ir nepieciešams ATP, un tie var būt lieli fermenti ar vairākām apakšvienībām. II tipa fermenti, kurus galvenokārt izmanto biotehnoloģijā, sagriež DNS atzītajā secībā bez ATP nepieciešamības un ir mazāki un vienkāršāki.
II tipa restrikcijas enzīmus nosauc pēc baktēriju sugām, no kurām tie ir izolēti. Piemēram, ferments EcoRI tika izolēts no E. koli. Lielākā sabiedrības daļa ir pazīstama ar E. coli uzliesmojumi pārtikā.
II tipa restrikcijas enzīmi var radīt divu dažādu veidu izcirtņus atkarībā no tā, vai tie sagriež abus šķipsnas atpazīšanas secības centrā vai katra virkne tuvāk atpazīšanas vienam galam secība.
Iepriekšējais griezums radīs "neasus galus" bez nukleotīdu pārkarēm. Pēdējais rada "lipīgus" vai "saliedētus" galus, jo katram iegūtajam DNS fragmentam ir pārkare, kas papildina pārējos fragmentus. Abas no tām ir noderīgas molekulārajā ģenētikā rekombinantā DNS un olbaltumvielas. Šī DNS forma izceļas ar to, ka to iegūst divu vai vairāku dažādu virkņu, kuras sākotnēji nebija savstarpēji savienotas, savienojot (savienojot kopā).
IV tipa fermenti atpazīst metilēto DNS, un V tipa fermenti izmanto RNS, lai izgrieztu sekvences iebrukušajiem organismiem, kas nav palindromi.
Izmantošana biotehnoloģijā
Restrikcijas enzīmus izmanto biotehnoloģijā, lai DNS sagrieztu mazākās šķipsnās, lai izpētītu fragmentu garuma atšķirības starp indivīdiem. To sauc par restrikcijas fragmenta garuma polimorfismu (RFLP). Tos izmanto arī gēnu klonēšanai.
RFLP metodes ir izmantoti, lai noteiktu, vai indivīdiem vai indivīdu grupām ir izteiktas atšķirības gēnu sekvencēs un restrikcijas šķelšanās modeļos noteiktos genoma apgabalos. Zināšanas par šīm unikālajām jomām ir pamats DNS pirkstu nospiedumu noņemšana. Katra no šīm metodēm ir atkarīga no agarozes gēla elektroforēze DNS fragmentu atdalīšanai. Agarozes želejā parasti izmanto TBE buferšķīdumu, kas sastāv no Tris bāzes, borskābes un EDTA elektroforēze izpētīt DNS produktus.
Izmantošana klonēšanā
Klonēšanai bieži ir nepieciešams gēnu ievietot plazmidā, kas ir DNS gabala tips. Restrikcijas enzīmi var palīdzēt šajā procesā, jo vienšūņu pārkaru dēļ viņi atstāj, veicot griezumus. DNS līze, kas ir atsevišķs ferments, var savienot divas DNS molekulas ar atbilstošiem galiem.
Tātad, izmantojot restrikcijas enzīmus ar DNS ligatūras fermentiem, DNS gabalus no dažādiem avotiem var izmantot, lai izveidotu vienu DNS molekulu.