PCR apzīmē polimerāzes ķēdes reakcija, molekulārās bioloģijas paņēmiens DNS segmentu pastiprināšanai, ģenerējot vairākas kopijas, izmantojot DNS polimerāzes enzīmus kontrolētos apstākļos. Tikai vienu DNS segmenta vai gēna eksemplāru var klonēt miljonos eksemplāru, ļaujot tos atklāt, izmantojot krāsvielas un citas vizualizācijas metodes.
Izstrādāts 1983. gadā, PCR process ļāva to veikt DNS sekvencēšana un identificēt nukleotīdu secību atsevišķos gēnos. Metodē izmanto termisko ciklu vai atkārtotu reakcijas sildīšanu un atdzesēšanu DNS kausēšanai un replikācijai. Turpinot PCR, “jauno” DNS izmanto kā šablonu replikācijai un notiek ķēdes reakcija, eksponenciāli pastiprinot DNS šablonu.
PCR metodes tiek izmantotas daudzās biotehnoloģijas jomās, ieskaitot olbaltumvielu inženierija, klonēšana, kriminālistika (DNS pirkstu nospiedumu noņemšana), paternitātes pārbaude, iedzimtu un / vai infekcijas slimību diagnostika un analīze vides paraugu.
Īpaši kriminālistikā PCR ir īpaši noderīga, jo tā pastiprina pat vismazāko DNS pierādījumu daudzumu. PCR var izmantot arī, lai analizētu DNS, kas ir tūkstošiem gadu veca, un šīs metodes tika izmantotas, lai identificētu visu, sākot no 800 000 gadu veca mamuta līdz mūmijām no visas pasaules.
PCR procedūra
Inicializācija
Šis solis ir nepieciešams tikai DNS polimerāzēm, kurām nepieciešama karstā starta PCR. Reakciju karsē līdz 94 līdz 96 ° C un tur 1-9 minūtes.
Denaturācija
Ja procedūrai nav nepieciešama inicializācija, pirmais solis ir denaturācija. Reakciju karsē līdz 94-98 ° C 20-30 sekundes. DNS šablona ūdeņraža saites tiek izjauktas, un tiek izveidotas vienas šķiedras DNS molekulas.
Rūdīšana
Reakcijas temperatūra ir zemāka par no 50 līdz 65 ° C un tiek turēta 20–40 sekundes. Gruntskrāsas apdedzinās ar vienpavediena DNS veidni. Šajā posmā temperatūra ir ārkārtīgi svarīga. Ja tas ir pārāk karsts, iespējams, grunts nesaistās. Ja tas ir pārāk auksts, gruntējums var saistīties nepilnīgi. Laba saite veidojas, kad gruntēšanas secība cieši sakrīt ar šablona secību.
Pagarināšana / pagarināšana
Temperatūra šīs darbības laikā mainās atkarībā no polimerāzes veida. DNS polimerāze sintezē pilnīgi jaunu DNS virkni.
Galīgais pagarinājums
Šis solis tiek veikts 70-74 ° C temperatūrā 5-15 minūtes pēc pēdējā PCR cikla.
Galīgā aizturēšana
Šis solis nav obligāts. Temperatūru uztur 4-15 ° C, un reakcija notiek.
Trīs PCR procedūras posmi
Eksponenciālā pastiprināšana
Katrā ciklā produkts (konkrēts DNS gabals, kas tiek replicēts) tiek dubultots.
Izlīdzinošais posms
Tā kā DNS polimerāze zaudē aktivitāti un patērē reaģentus, reakcija palēninās.
Plato
Vairs produkts neuzkrājas.