Kā darbojas polimerāzes ķēdes reakcija, lai pastiprinātu gēnus

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir molekulārā ģenētiskā metode vairāku gēna kopiju izgatavošanai, un tā ir arī daļa no gēnu sekvencēšanas procesa.

Gēnu kopijas tiek izgatavotas, izmantojot DNS paraugu, un tehnoloģija ir pietiekami laba, lai no vienas paraugā atrastā gēna kopijas izgatavotu vairākas kopijas. Gēna PCR pastiprināšana, lai izveidotu miljoniem kopiju, ļauj noteikt un identificēt gēnu sekvences, izmantojot vizuālas metodes, kuru pamatā ir DNS gabala izmērs un lādiņš (+ vai -).

Kontrolētos apstākļos nelielus DNS segmentus ģenerē fermenti, kas pazīstami kā DNS polimerāzes, kas pievieno papildu dezoksinukleotīdus. (dNTP) DNS daļai, kas pazīstama kā "veidne". Pat mazāki DNS gabali, ko sauc par "primeriem", tiek izmantoti kā sākumpunkts polimerāze.

Praimeri ir mazi mākslīgi DNS gabali (oligomēri), parasti no 15 līdz 30 nukleotīdiem gari. Tos veido, zinot vai uzminot īsas DNS sekvences pastiprināmā gēna pašos galos. PCR laikā sekvencējamā DNS tiek uzkarsēta un dubultās virknes atdalās. Pēc atdzesēšanas gruntskrāsas saistās ar veidni (ko sauc par atkvēlināšanu) un izveido vietu polimerāzes sākumam.

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) bija iespējama, atklājot termofilus un termofilus polimerāzes enzīmi (enzīmi, kas saglabā struktūras integritāti un funkcionalitāti pēc karsēšanas augstā temperatūrā temperatūras). PCR tehnikas darbības ir šādas:

• Tiek izveidots maisījums ar optimizētām DNS veidnes, polimerāzes enzīma, praimeru un dNTP koncentrācijām. Spēja sildīt maisījums bez enzīma denaturēšanas ļauj denaturēt DNS parauga dubulto spirāli 94 grādu temperatūrā Celsija.
• Pēc denaturācijas paraugs tiek atdzesēts līdz mērenākam diapazonam, aptuveni 54 grādiem, kas atvieglo praimeru atkausēšanu (saistīšanos) ar vienpavedienu DNS veidnēm.
• Cikla trešajā solī paraugu atkārtoti uzsilda līdz 72 grādiem, kas ir ideāla temperatūra Taq DNS polimerāzei pagarinājumam. Pagarināšanas laikā DNS polimerāze izmanto sākotnējo vienu DNS virkni kā veidni, lai pievienotu komplementārus dNTP. uz katra praimera 3’ galiem un ģenerē divpavedienu DNS sekciju interesējošā gēna reģionā.
• Praimeri, kas ir atkvēlināti ar DNS sekvencēm, kuras nav precīzas, nepaliek atkvēlinātas 72 grādos, tādējādi ierobežojot interesējošā gēna pagarinājumu.

Šis denaturēšanas, atkausēšanas un pagarināšanas process tiek atkārtots vairākas (30–40) reizes, tādējādi eksponenciāli palielinot vēlamā gēna kopiju skaitu maisījumā. Lai gan šis process būtu diezgan nogurdinošs, ja to veiktu manuāli, paraugus var sagatavot un inkubēt a programmējams Thermocycler, kas tagad ir ierasts lielākajā daļā molekulāro laboratoriju, un pilnīgu PCR reakciju var veikt 3-4 stundas.

Katrs denaturēšanas solis aptur iepriekšējā cikla pagarināšanas procesu, tādējādi saīsinot jauno DNS virkni un saglabājot to aptuveni līdz vēlamā gēna izmēram. Pagarinājuma cikla ilgumu var pagarināt vai saīsināt atkarībā no interesējošā gēna lieluma, bet galu galā, izmantojot atkārtotus PCR, lielākā daļa veidņu tiks ierobežotas tikai ar interesējošā gēna izmēru, jo tās tiks ģenerētas no abu gruntskrāsas.

Ir vairāki dažādi faktori veiksmīgai PCR ar kurām var manipulēt, lai uzlabotu rezultātus. Visplašāk izmantotā metode PCR produkta klātbūtnes pārbaudei ir agarozes gēla elektroforēze. Kas tiek izmantots, lai atdalītu DNS fragmentus, pamatojoties uz izmēru un lādiņu. Pēc tam fragmentus vizualizē, izmantojot krāsvielas vai radioizotopus.

Kopš PCR atklāšanas ir atklātas citas DNS polimerāzes, izņemot sākotnējo Taq. Dažiem no tiem ir labāka "korektūras" spēja vai tie ir stabilāki augstākā temperatūrā, tādējādi uzlabojot PCR specifiku un samazinot kļūdas, kas rodas, ievietojot nepareizu dNTP.

Dažas PCR variācijas ir izstrādātas īpašiem lietojumiem, un tagad tās regulāri izmanto molekulārās ģenētiskās laboratorijās. Daži no tiem ir reāllaika PCR un reversās transkriptāzes PCR. PCR atklāšana ir arī novedusi pie DNS sekvencēšanas attīstības, DNS pirkstu nospiedumu noņemšana un citas molekulārās metodes.